M-MLV ters transkripsiýa
RevScript Ters transkriptaz genetiki in engineeringener tehnologiýasy arkaly alynýar.Has ýokary cDNA sintez ukyby, ýylylyk durnuklylygy we reaksiýanyň temperatura çäkleri (60 ° C çenli) bar.Sintezlenen cDNA önümi 10 kb çenli.Şablonlaryň ýakynlygyny ýokarlandyrýar we çylşyrymly ikinji derejeli gurluş ýa-da pes göçürme genleri bolan RNK şablonlarynyň ters transkripsiýasy üçin amatly.
Komponentler
| Komponent | HC2003B-01 (10,000U) | HC2003B-02 (5 * 10,000U) | HC2003B-03 (200,000U) |
| RevScript ters transkripsiýasy (200U / μL) | 50 μL | 5 × 50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript buferi | 250 μL | 1,25 ml | 5 ml |
Saklamak ýagdaýy
Bu önüm 2 ýyl -25 ° C ~ -15 ° C derejesinde saklanmalydyr.
Bölüm kesgitlemesi
Bir bölüm, Oligo (dT) -ni primer hökmünde ulanyp, 37 ° C-de 10 minutda 1 nmol dTTP kislotada eräp bilmeýän materiallara goşýar.
Reaksiýa gurmak
1. RNK şablonynyň bölünişi (Bu ädim islege bagly, RNK şablonynyň denatasiýasy ikinji derejeli gurluşlary açmaga kömek edýär, bu bolsa birinji hatar cDNA-nyň hasyllylygyny ýokarlandyrar.)
| Komponentler | Ses (μL) |
| Mugt ddH2O | 13-e çenli |
| Oligo (dT)18 (50 olmol / L) ýa-da tötänleýin primer (50 olmol / L) Gena-da gen aýratynlyklary (2 olmol / L) | 1 |
| ýa-da 1 | |
| ýa-da 1 | |
| RNK şablony | X.a |
Bellikler:
1) a: Jemi RNK: 1-5 ug ýa-da mRNA: 1-500 ng
2) 65 ° C-de 5 minutlap inkubasiýa etmek, soň bolsa 2 minut sowatmak üçin derrew buzda geçirmek.Reaksiýa suwuklygyny ýygnamak, aşakdaky tablisada görkezilişi ýaly ters transkripsiýa reaksiýa çözgüdini goşmak üçin gysga merkezden gaçyryş.Garyşdyrmak üçin ýuwaşja turba.
1. Reaksiýa garyndysyny taýýarlamak (20 μL göwrüm)
| Komponentler | Ses (μL) |
| Öňki ädimiň garyndysy | 13 |
| 5 × Bufer | 4 |
| dNTP garyndysy (10nmol / L) | 1 |
| Ters transkriptaz (200 U / μL) | 1 |
| RNase inhibitory (40 U / μL) | 1 |
1.Reaksiýany aşakdaky şertlerde ýerine ýetiriň:
| Temperatura (° C) | Wagt |
| 25 ° C.a | 5min |
| 42 ° C.b | 15-30 minut |
| 85 ° C.c | 5min |
Bellikler:
1) a.5 minut üçin 25 ° C inkubasiýa diňe tötänleýin geksamerleri ulanmak üçin zerurdyr.Oligo (dT) ulananyňyzda bu ädimden geçmegiňizi haýyş edýäris18ýa-da gen aýratyn primer.
2) b.Maslahat berilýän ters transkripsiýa temperaturasy 42 ° C, Çylşyrymly ikinji derejeli gurluşlar ýa-da ýokary GC mazmuny bolan şablonlar üçin reaksiýanyň temperaturasyny 50-55 ° C çenli ýokarlandyrmak maslahat berilýär.
3) c.Ters transkriptazany hereketsizleşdirmek üçin 85 minutda 5 minut gyzdyrmak.
4) Önüm PCR ýa-da qPCR reaksiýalarynda gönüden-göni ulanylyp bilner ýa-da gysga möhletli saklamak üçin -20 ° C derejesinde saklanyp bilner.Önümleri sazlamak we uzak möhletli saklamak üçin -80 ° C derejesinde saklamak maslahat berilýär.Frequygy-ýygydan doňdurmakdan gaça duruň.
5) Önüm bir basgançakly RT-qPCR üçin amatly, her 25μL reaksiýa ulgamy üçin 10-20 U ters transkriptaz goşmak ýa-da hakyky ýagdaýa görä ters transkriptazanyň mukdaryny kem-kemden köpeltmek maslahat berilýär.
Bellikler
1.Synag meýdançasyny arassa saklamagyňyzy haýyş edýäris;Iş wagtynda arassa ellikler we maskalar geýilmelidir.Synagda ulanylýan ähli sarp edilýän zatlar, RNase hapalanmagynyň öňüni almak üçin RNase erkin bolmaly.
2. RNK-nyň zaýalanmagynyň öňüni almak üçin buzda ähli amallar edilmelidir.
3. Tersine transkripsiýanyň ýokary netijeliligini üpjün etmek üçin ýokary hilli RNK nusgalary maslahat berilýär.
4.Bu önüm diňe gözleg üçin.
5. Howpsuzlygyňyz üçin laboratoriýa palto we bir gezek ulanylýan ellikler bilen işlemegiňizi haýyş edýäris.
