RTL ters ýazgy
RTL ters transkriptaz, 3 '→ 5' ekzonukleýasiýa işjeňligi bolmadyk we RNase H işjeňligi bolan RNK şablonyna bagly DNK polimeraza.Bu ferment, esasanam RT-LAMP (aýlawly izotermiki güýçlendirme) üçin birinji hatar CDNA sintezine ulanylyp bilinýän DNK-nyň goşmaça setirini sintez etmek üçin RNK-ny şablon hökmünde ulanyp biler.RTL ters transkriptaz 1.0 bilen deňeşdirilende duýgurlyk ep-esli gowulaşýar, ýylylyk durnuklylygy has güýçli we 65 ° C-de reaksiýa has durnukly.Lýofilizirlenen taýýarlyklary, lyofilizirlenen RT-LAMP reagentlerini we ş.m. taýýarlamak üçin RTL ters transkriptaz (gliserol erkin) ulanylyp bilner.
Bölüm kesgitlemesi
Bir birlik, poli (A) • oligo (dT) 25-ni şablon-primer hökmünde ulanyp, 50 ° C-de 20 minutda kislota çökýän materiallara 1 nmol dTTP goşýar.
Komponentler
| Komponent | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL ters transkriptaz (gliserolsyz) (15U / μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10 × HC RTL buferi | 1,5 ml | 4 × 1,5 ml | 5 × 10 ml |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 3 × 10 ml |
Saklamak ýagdaýy
0 ° C-den pes transport we -25 ° C ~ -15 ° C derejesinde saklanar.
Hil barlagy
- Galyndy işjeňligiEndonuclease:1 μg λDNA we 15 birlik RTL2.0 öz içine alýan 50 μL reaksiýa, 37 at 16 sagatda inkubasiýa edilen, gel elektroforezi tarapyndan negatiw gözegçilik ýaly nagyş görkezýär.
- Galyndy işjeňligiExonuclease:1 μg Hind Ⅲ siňdirilen λDNA we 15 birlik RTL2.0 öz içine alýan 50 μL reaksiýa, gel rop elektroforeziň negatiw gözegçiligini görkezýär.
- Galyndy işjeňligiNikase:1 μg ýokary derejeli pBR322 we 15 birlik RTL2.0 öz içine alýan 50 μL reaksiýa, 37 ° C-de 4 sagatlap inkubasiýa edildi, gel elektroforezi tarapyndan negatiw gözegçilik ýaly nagyş görkezýär.
- Galyndy işjeňligiRNase:0,48 μg MS2 RNA we 15 birlik RTL2.0 öz içine alýan 10 μL reaksiýa, 37 ° C-de 4 sagatlap inkubasiýa edildi, gel elektroforezi tarapyndan negatiw gözegçilik ýaly nagyş görkezýär.
- E. coli gDNK:Bilen ölçeldiE.coliýörite HCD kesgitleýiş toplumlary RT 15 birlik RTL2.0 1-den azE. coligenom.
Reaksiýa gurmak
cDNA sintez protokoly
| Komponentler | Ses |
| Şablon RNK a | islege bagly |
| Oligo (dT) 18 ~ 25 (50uM) ýa-da tötänleýin primer garyndysy (60uM) | 2 μL |
| dNTP garyndysy (hersi 10mM) | 1 μL |
| RNase inhibitory (40U / uL) | 0,5 μL |
| RTL ters transkriptaz 2.0 (15U / uL) | 0,5 μL |
| 10 × HC RTL buferi | 2 μL |
| Ucadrosyz suw | 20 μL çenli |
Bellikler:
1) Jemi RNK-nyň maslahat berilýän dozasy 1ng ~ 1μg
2) mRNA-nyň maslahat berilýän dozasy 50ng ~ 100ng boldy
Termo-welosiped sürmek Adaty şertler reaksiýa ：
| Temperatura (° C) | Wagt |
| 25 ° C.a | 5min |
| 55 ° C. | 10 minutb |
| 80 ° C. | 10 minut |
Bellikler:
1) Eger tötänleýin primer garyndysy ulanylsa, 25 ° C-de inkubasiýa ädimi.
2) Maksatly primer garyndysy ulanylsa, 10 ~ 30minut üçin 55 ° C inkubasiýa ädimi.
RT-LAMP teswirnamasy
| Komponentler | Ses | Jemleýji konsentrasiýa |
| Şablon RNK | islege bagly | ≥10 nusga |
| dNTP garyndysy (10mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP / BIP başlangyçlary (25 ×) | 1 μL | 1,6 MM |
| F3 / B3 Primerler (25 ×) | 1 μL | 0,2 MM |
| LoopF / LoopB Primerleri (25 ×) | 1 μL | 0,4 MM |
| RNase inhibitory (40U / μL) | 0,5 μL | 20 U / reaksiýa |
| RTL ters transkriptaz 2.0 (15U / μL) | 0,5 μL | 7.5 U / reaksiýa |
| Bst V2 DNK polimeraza (8U / μL) | 1 μL | 8 U / reaksiýa |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mM (Jemi 8 mM) |
| 10 × HC RTL buferi (ýa-da 10 × HC Bst V2 bufer) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2 +) |
| Ucadrosyz suw | 25 μL çenli | - |
Bellikler:
1) collectygnamak üçin gysga wagtda worteksing we sentrifugany garmaly.1 sagatlap 65 ° C-de yzygiderli temperatura inkubasiýa.
2) Iki bufer biri-biri bilen işleşip, birmeňzeş kompozisiýa eýe.
Bellikler
1.Bu önüm -20 ° C-de saklananda ak gaty emele geler.-20 ° C-den çykaryň we takmynan 10 minut buzda goýuň.Eredilenden soň silkmek we garyşdyrmak arkaly ulanyp bolýar.
2. CDNA önümi -20 ° C ýa-da -80 ° C derejesinde saklanyp ýa-da derrew PCR reaksiýasy üçin ulanylyp bilner.
3. RNase hapalanmagynyň öňüni almak üçin synag meýdançasyny arassa saklaň we iş wagtynda arassa ellik we maska geýiň.
