Iki hatar RNK (dsRNA) ELISA KIT

Bu toplum, yzygiderliligine garamazdan, 60 esasy jübütden (bp) ýokary bolan dsRNA-ny mukdar taýdan ölçemek üçin biotin-Streptawidin ulgamy bilen birleşdirilen ferment bilen baglanyşykly immunosorbent barlagy (ELISA).Tabak öňünden dsRNA antikor bilen örtüldi.Mysalda bar bolan dsRNA goşulýar we guýularda örtülen antikorlara baglanýar.Soň bolsa biotinilleşdirilen anti-dsRNA antikor goşulýar we nusgadaky dsRNA bilen baglanyşýar.Hinguwlandan soň HRP-Streptawidin goşulýar we Biotinilleşdirilen anti-dsRNA antikoryna baglanýar.Inkubasiýadan soň HRP-Streptawidin ýuwulýar.Soňra TMB substrat ergini HRP tarapyndan goşulýar we katalizlenýär, kislotaly stop ergini goşulandan soň sary reňkde gök reňk önümi öndürilýär.Sarylygyň dykyzlygy, tabakda alnan dsRNA-nyň maksat mukdaryna proporsionaldyr.Siňdiriş 450 nm bilen ölçelýär.

Arza

Bu toplum galyndy dsRNA-ny mukdar taýdan ölçemek üçin.

Kit komponentleri

Saklamak we durnuklylyk

1. Ulanylmaýan toplum üçin: kithli saklanyş möhletinde 2 ~ 8 at saklanyp bilner.Saklamagyň durnuklylygy üçin güýçli yşykdan gaça durmaly.

2. Ulanylan toplum üçin: Mikroplat açylansoň, ulanylmadyk guýulary plastinka möhürleýji bilen ýapyň we desikant paketini öz içine alýan folga haltasyna gaýdyň, folga haltasyny möhürläň we ulanylandan soň gysga wagtda 2 ~ 8 back gaýdyp geliň.Beýleki reagentler ulanylandan soň gysga wagtda 2 ~ 8 to yzyna gaýtarylmaly.

Gerekli materiallar, ýöne üpjün edilmeýär

1. 450 ± 10nm süzgüçli mikroplat okyjy (450 we 650 nm tolkun uzynlygyny kesgitläp bilseňiz has gowy).

2. Mikroplat sarsdyryjy.

3. RNazsyz maslahatlar we sentrifuga turbalary.

“Flowchart” operasiýasy

Başlamazdan ozal

1. Kithli komponentleri we nusgalary ulanmazdan ozal otag temperaturasyna (18-25 ℃) getiriň.Kitap bir gezek ulanylmasa, häzirki synag üçin diňe zolaklary we reagentleri çykaryň we galan zolaklary we reagentleri zerur ýagdaýda goýuň.

2. Washuwmak buferi: 40mL 20 × konsentrirlenen ýuwujy buferi 760mL deionizirlenen ýa-da distillendirilen suw bilen 800mL 1 × ýuwujy bufer taýýarlaň.

3. Standart: ulanmazdan ozal aksiýa erginini gysga aýlaň ýa-da merkezden gaçyryň.Berilýän dört standartyň konsentrasiýasy 5ng / μL.UTP we pUTP dsRNA ülňüleri üçin, adaty egrini çyzmak üçin aksiýa çözgüdini 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg / μL çenli eritiň.N1-Me-pUTP dsRNA ülňüleri üçin, adaty egrini çyzmak üçin aksiýa çözgüdini 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg / μL çenli eritiň.5-OMe-UTP dsRNA standarty üçin, adaty egrini çyzmak üçin STE buferi bilen aksiýa çözgüdini 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg / μL çenli eritiň.Standartlary aşakdaky diagrammalar ýaly garyşdyrmagy maslahat berýäris:

4. Biotinilleşdirilen kesgitleýji antikor we HRP-streptawidin iş ergini: ulanmazdan ozal aksiýa erginini gysga aýlaň ýa-da merkezden gaçyryň.Olary eritme buferi bilen iş konsentrasiýasyna garyşdyryň.

5. TMB substaty: erginiň zerur dozasyny sterilizasiýa edilen maslahatlar bilen isläň we galyndy erginini gaýtadan flakona taşlamaň.TMB substaty ýagtylyga duýgur, TMB substratyny uzak wagtlap ýagtylyga sezewar etmäň.

Protokol ulanmak

1. Derňew üçin zerur zolaklaryň sanyny kesgitläň.Zolaklary ulanmak üçin çarçuwalara salyň.Bu analizde ulanylmadyk galan plastinka zolaklary sumkada desikant bilen yzyna gaýtarmaly.Sowadyjy saklamak üçin sumkany berk ýapyň.

2. Degişli guýulara standart, boş we nusgalaryň hersini 100μL goşuň.Tabak möhürleýji bilen örtüň.500 sagatda titremek bilen otag temperaturasynda 1 sagat inkubasiýa ediň.Nusgalary takyk öwrenmek üçin degişli konsentrasiýa üçin STE buferi bilen garyşdyrmaly.

3. stepuwmak ädimi: Ergini isläň we her guýy üçin 250μL ýuwujy bufer bilen ýuwuň we 30-a çenli goýuň.Tabagy sorujy kagyzyň üstüne sokup, ýuwujy buferi doly taşlaň.Jemi 4 gezek ýuwuň.

4. Her guýa 100μL biotinilleşdirilen kesgitleýji antikor iş erginini goşuň.Tabak möhürleýji bilen örtüň.500 sagatda titremek bilen otag temperaturasynda 1 sagat inkubasiýa ediň.

5. washuwmak ädimini gaýtalaň.

6. Her guýa 100μL HRP-streptawidin iş erginini goşuň.Tabak möhürleýji bilen örtüň.500rpm-de titremek bilen otag temperaturasynda 30 minut inkubasiýa ediň.

7. washuwmak ädimini gaýtalaň.

8. Her guýa 100μL TMB substrat erginini goşuň.Tabak möhürleýji bilen örtüň.RT-de 30 minut inkubasiýa ediň. Lightagtylykdan goraň.Suwuklyk substrat ergininiň goşulmagy bilen gök öwüsýär.

9. Her guýa 50μL stop ergini goşuň.Suwuklyk, ergin ergininiň goşulmagy bilen sary öwrüler.Soňra mikroplat okyjyny işlediň we derrew 450nm ölçeg geçiriň.

Netijeleri hasaplamak

1. Her standart, gözegçilik we nusgalar üçin ortaça okalýan ortaça okaň we ortaça nol standart optiki dykyzlygy aýyryň.Dikligine (Y) okuna we gorizontal (X） okunda) dsRNA konsentrasiýasy bilen adaty egrini guruň.

2. Hasaplamany 5 ýa-da 4 parametrli çyzykly däl modelde egrilik hünärmeni 1.3 ýa-da ELISA Calc ýaly kompýuter esasly egrilik programma üpjünçiligi bilen ýerine ýetirmek maslahat berilýär.

Çykyş

1. Duýgurlyk:

kesgitlemegiň aşaky çägi: ≤ 0,001pg / μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA üçin), ≤ 0.01pg / μL (5-OMe-UTP-dsRNA üçin).

mukdar derejesiniň pes çägi: 0.0156 pg / μL (UTP-, pUTP-dsRNA üçin), 0.0312 pg / μL (N1-Me-pUTP-dsRNA üçin), 0.0625 pg / μL (5-OMe-UTP-dsRNA üçin).

2. Takyklyk: Içerki analiziň CV ≤10%, Aralyk derňewiň CV ≤10%

3. Dikeldiş: 80% ~ 120%

4. Çyzyk: 0.0156-0.5pg / μL (forUTP-, pUTP-dsRNA) 0.0312-1pg / μL (forN1-Me-pUTP dsRNA üçin), 0.0625-1pg / μL (5-OMe-UTP-dsRNA üçin).

Pikirler

1. TMB reaksiýanyň temperaturasy we wagty gaty möhümdir, görkezmä laýyklykda berk gözegçilik ediň.

2. Gowy analiz öndürijiligini we duýgurlygyny gazanmak üçin, reaksiýa berilmedik reagentleri aýyrmak üçin tabaklary dogry ýuwmak zerurdyr.

3. reagentleri ulanmazdan ozal gowy garyşdyrylmaly we nusga ýa-da reagentler goşulanda bökdençliklerden gaça durmaly.

4. Konsentrirlenen ýuwujy buferde (20x) kristallar emele gelen bolsa, 37 to çenli gyzdyryň we kristallar doly erýänçä ýuwaşlyk bilen garmaly.

5. Natriý Azide (NaN3) öz içine alýan nusgalary öwrenmekden gaça duruň, sebäbi dsRNA mukdaryna baha berilmezligi sebäpli HRP işjeňligini ýok edip biler.

6. Derňew wagtynda RNase hapalanmagyndan gaça duruň.

7. Adaty / nusga, kesgitleýji antikor we SA-HRP hem titremesiz RT-de geçirilip bilner, ýöne bu kesgitleme duýgurlygynyň bir esse azalmagyna sebäp bolup biler.Bu ýagdaýda UTP we pUTP dsRNA ülňülerini 2pg / μL-den, N1-Me-pUTP dsRNA standartlaryny 4pg / μL-den, 5-OMe-UTP dsRNA standartyny 8pg / μL-den peseltmegi maslahat berýäris.Mundan başga-da, otag temperaturasynda 60 minut HRP-streptawidin iş erginini inkubasiýa ediň.Çüýşe şekerini ulanmaň, sebäbi çüýşe şeker nädogry netijä getirip biler.

Adaty netije

1. Adaty egrilik maglumatlary

2. Adaty egrini hasaplamak

3. Çyzgylary kesgitlemek aralygy: 0.0312- 1pg / μL