EndoFree Plazmid Maxi Kit
Bu toplum, bakteriýalary lizlemek üçin gowulandyrylan SDS-gidroksidi liz usulyny ulanyp, bir gijede ösdürilip ýetişdirilen 150 - 300 ml bakteriýa ergininden çykarmak üçin amatlydyr.Çig ekstrakt özboluşly Endotoksin Scavenger bilen saýlanyp birleşdirilýär we endotoksinleri aýyrmak üçin sentrifugasiýa bilen bölünýär.Soňra, kremniniň gel membranasy ýokary duzly we pes pH şertlerinde ergindäki plazmaid DNK bilen saýlanýar.Ondan soň näsazlyklary we beýleki bakteriýa komponentlerini aýyrmak üçin ýuwujy bufer goşulýar.Ahyrynda, kremniý matrisa membranasyndan arassa plazmid DNK-ny çykarmak üçin az duzly, ýokary pH elitasiýa buferi ulanylýar.Silisiýa jel membranasynda ýörite adsorbsion membranasy ulanylýar we sütün bilen sütüniň arasyndaky adsorbsion mukdary tapawudy gaty az we gaýtalanmagy gowy.Fenol, hloroform we beýleki zäherli reagentler talap edilmeýär we etanol ýagyş ädimleri hem ýok.Bu toplum, çykaryş derejesi 80% -90% bolan arassa ýokary göçürme plazmid DNK-dan 0,2 -1,5 mg çalt çykarmak üçin ulanylyp bilner.Kitapda endotoksini aýyrýan özboluşly proses formulasy ulanylýar, endotoksiniň düzümi gaty pes we öýjügiň transfeksiýa täsiri ajaýyp.Çykarylan plazmid ferment siňdirişinde, PCR-de, vitro transkripsiýasynda, öwrülişikde, yzygiderlilikde we beýleki molekulýar biologiýa synaglarynda ulanylyp bilner.
Saklamak şertleri
RNaseA -30 ~ -15 at derejesinde saklanmaly we ≤0 at daşalmaly.
Endotoksin Scavenger, bir aýda 2 ~ 8 at, uzak wagtlap saklamak üçin -30 ~ -15 at derejesinde saklanyp bilner.we ≤0 at daşalýar.
Beýleki komponentler otag temperaturasynda (15 ~ 25 ℃) saklanmaly we otag temperaturasynda daşalmaly.
Komponentler
| Komponentler | 10RXNS |
| RNase A. | 750 μL |
| Bufer P1 | 75 ml |
| Bufer P2 | 75 ml |
| Bufer P4 | 75 ml |
| Endotoksin Scavenger | 25 ml |
| Bufer PW | 2 × 22 ml |
| Bufer inçekeseli | 20 ml |
| “FastPure DNA Maxi” sütünleri (hersi 50ml kolleksiýa turbasynda) | 10 |
| Endotoksinsiz kolleksiýa turbasy | 2 × 5 |
RNaseA:RNK-ny aýyrmak üçin ulanylýan 10 mg / ml.
Bufer P1:bakterial asma buferi, ilkinji ulanmazdan ozal Buffer P1-e RNaseA goşuň.
Bufer P2:bakterial liz buferi (SDS / NaOH öz içine alýar).
Bufer P4:zyýansyzlandyryjy bufer.
Endotoksin Scavenger:endotoksini çig plazmid ekstraktyndan netijeli aýyryň.
Bufer PW:buferi ýuwuň, ilkinji gezek ulanmazdan ozal göz öňünde tutulan mukdary goşuň.
Bufer inçekeseli:elitasiýa buferi.
“FastPure DNA Maksi” sütünleri:plazmid DNK adsorbsion sütünleri.
Kolleksiýa turbalary 50 ml:ýygnamak turbalaryny süzüň.
Endotoksinsiz kolleksiýa turbasy:plazmid DNK ýygnamak turbalary.
Taýýarlanan materiallar
Mutlak etanol, izopropanol, 50 ml tegelek aşaky sentrifuga turbalary we 50 ml endotoksin ýoksentrifuga turbalary.
Goýmalar
Bu önüm 150-300 ml bakteriýa ergininden plazmidleri uly göwrümli çykarmak üçin amatlydyrbir gijede medeniýetli.
Synag prosesi
1. Bir gijede ösdürilip ýetişdirilen bakteriýa ergininiň 150 - 200 ml (300 ml-den köp bolmaly däl) we sentrifugany alyňtakmynan 11,000 rpm (12,000 × g) 1 - 2 minut.Adatdan daşary tebigaty taşlaň we bakteriýalary ýygnaň.
50 50 ml-den gowrak bakteriýa ergini ýygnananda, bakteriýalary bakteriýa ergini, sentrifugasiýa goşmak, adatdan daşary tebigaty we şol bir 50 ml turbadaky beýleki ädimleri taşlamak arkaly ýygnap bolýar.
birnäçe gezek.
2. Merkezden gaçyryş enjamyna 7.5 ml Buffer P1 goşuň (RNaseA-nyň Buffer P1-e goşulandygyny ýa-da ýokdugyny barlaň)bakteriýalary öz içine alýan turba we worteks ýa-da turbalar bilen gowy garmaly.
This Bu ädimdäki bakteriýalaryň doly reanimasiýasy hasyl bermek üçin möhümdir we reanimasiýadan soň bakteriýa bölekleri bolmaly däldir.Gowy garyşmadyk bakteriýa bölekleri bar bolsa, lizise täsir eder, netijede pes hasyl we arassalyk bolar.Bakteriýa ergininiň OD600 0,65 bolsa, 150 ml bakteriýa ergininden çykarylanda 7,5 ml Buffer P1 ulanmak maslahat berilýär;OD600 0,75 bolanda, 8 ml Buffer P1 ulanylmaly we Buffers P2 we P4 göwrümleri şoňa görä üýtgedilmeli.Bakteriýa ergininiň mukdary 200 ml çenli köpelse, maslahat berilýärBuferleriň P1, P2 we P4 mukdary proporsional ýokarlanýar.
3. 2-nji ädimden bakterial süspensiýa 7.5 ml Buffer P2 goşuň we 6 - 8 üçin ýuwaş-ýuwaşdan garyşdyryň.gezek we otag temperaturasynda 4-5 minut inkubasiýa ediň.
Ly Gowy garyşdyrmak üçin ýuwaşlyk bilen öwüriň.Worteksing genom DNK-nyň bölünmegine sebäp bolar, netijede çykarylan plazmada genom DNK bölekleri bolar.Bu wagt, ergin bakteriýalaryň doly lizirlenendigini görkezip, ýelmeşýär we aýdyň bolýar.Plazmidleriň ýok edilmezligi üçin dowamlylygy 5 minutdan geçmeli däldir.Çözüw düşnüksiz bolsa, netijede bakteriýalar gaty köp bolup bilerdoly däl liz, şonuň üçin bakteriýalaryň mukdary degişli derejede azaldylmalydyr.
4. 3-nji ädimden bakteriýa saklanyşyna 7.5 ml Buffer P4 goşuň we erginiň Buffer P2-ni doly zyýansyzlandyrmagy üçin derrew 6 - 8 gezek ýuwaşlyk bilen öwüriň.Bu wagt ak reňkli çökündiler peýda bolmaly.Takmynan 11,000 aýlawdan (12,000 × g) 10-15 minutda sentrifuga, adatdan daşary tebigaty seresaplylyk bilen täze 50 ml tegelek aşaky sentrifuga turbasyna siňdiriň we özüňiz saklaňýüzýän ak çökgünlige ymtylmak.
Buff Bufer P4 goşuň we gowy garmak üçin derrew tersine.Turbany bitaraplyga täsir edip biljek ýerli ygalyň öndürilmeginiň öňüni almak üçin, ak çökgünlik erginiň hemme ýerinde deň paýlanýança dur.Merkezden gaçyryşdan ozal birmeňzeş ak flokulent çökgünlik ýok bolsa we sentrifugadan soň adatdan daşary tebigat düşnüksiz bolsa, turba bolup bilerýene 5 minut merkezden gaçyryldy.
5. Endotoksin Scavenger-iň göwrüminden 1 esse (adatdan daşary göwrümiň 10%, takmynan 2,2 ml) 4-nji ädimden adatdan daşary tebigata goşuň we garyşdyryň.Ergini buz hammamyna salyň ýa-da eriş turbidden tä aýdyň we aç-açan üýtgeýänçä (ýa-da henizem) ezilen buzda (ýa-da holodilnikde) 5 minut goýuň.birneme bulaşyk) we wagtal-wagtal birnäçe gezek garmaly.
End Endotoksin Scavenger adatdan daşary tebigata goşulandan soň, adatdan daşary tebigat bulaşyk bolar, ýöneadatdan daşary tebigat buz wannasynda sowadylandan soň düşnükli bolmaly (ýa-da birneme bulaşyk).
6. Adatdan daşary tebigat otag temperaturasynda (> 25 ℃) 10-15 minut ýerleşdirilenden soň, bulaşyk bolar.temperaturasy otag temperaturasyna çenli ýokarlanýar.Soňra garyndyny garyşdyrmak üçin tersine öwürmeli.
Room Otagyň temperaturasy pes bolsa ýa-da gazyp almak wagtyny azaltmak isleseňiz, adatdan daşary tebigat 37 ~ 42 ℃ suw wannasynda 5-10 minut inkubasiýa edilip bilner we indiki ädim adatdan daşary tebigatdan soň amala aşyrylyp bilner.bulaşyk bolýar.
7. Fazany aýyrmak üçin adatdan daşary tebigaty takmynan 11,000 aýlawda (12,000 × g) 10 minutda otag temperaturasynda (temperatura> 25 must bolmaly) merkezden gaçyryň.Upperokarky suw fazasynda DNK bar, aşaky gök ýagly faza gatlagynda endotoksin we beýleki hapalar bar.GeçirDNK öz içine alýan suw fazasy täze turba weýagly gatlagy taşlaň.
Cent Merkezden gaçyryş döwründe temperatura 25-den ýokary bolmaly, sebäbi fazanyň täsirli bölünişi ýoktemperatura gaty pes bolsa ýüze çykýar.
The Fazany bölmek täsirli bolmasa, merkezden gaçyryş temperaturasy 30 ℃ wemerkezden gaçyryş wagtyny 15 minuta çenli artdyryp bolar.
Blue Mawy ýagly gatlagy emdirmäň, sebäbi düzüminde endotoksin we beýleki hapalar bar.
Mehanizm
Resuspensiýa liziniň bitaraplygy
7. 7.5 ml Bufer P1 goşuň
7. 7.5 ml Bufer P2 goşuň
7. 7.5 ml Bufer P4 goşuň
Endotoksin aýyrmak
End Endotoksin Scavenger-iň adatdan daşary göwrüminden 1 esse goşuň
Baglamak we ýuwmak
Is Izopropanolyň göwrüminden 0,5 esse goşuň
10 10 ml Bufer PW goşuň
10 10 ml Bufer PW goşuň
Elution
1 1 - 2 ml Bufer inçekeseli ýa-da Endotoksinsiz ddH2O goşuň
