M-MLV Neoscript ters transkriptaz
Neoscript ters transkriptazasy, Moloneý murin leýkoz wirusynyň gelip çykyşy we E.coli-de ýüze çykmagy M-MLV geniniň mutasiýa barlagy netijesinde alnan ters transkriptazdyr.Ferment RNase H işjeňligini aýyrýar, has ýokary temperatura çydamlylygy we ýokary temperatura ters transkripsiýasy üçin amatly.Şol sebäpli, RNK-nyň ýokary derejeli gurluşynyň we aýratyn däl faktorlaryň CDNA sintezine ýaramaz täsirlerini ýok etmek üçin peýdalydyr we has ýokary durnuklylygy we ters transkripsiýa sintez ukybyna eýe.Ferment has ýokary durnuklylyga we ters transkripsiýa sintez ukybyna eýe.
Komponentler
1.200 U / μL Neoscript ters transkriptaz
2.5 × Birinji hatar bufer (islege görä)
* 5 × Birinji hatar buferde dNTP ýok, reaksiýa ulgamyny taýýarlanyňyzda dNTP goşuň
Maslahat berilýän anketa
1.Bir ädimli qRT-PCR.
2.RNK wirusyny anyklamak.
Saklamak ýagdaýy
Uzak möhletli saklamak üçin -20 ° C, ulanmazdan ozal gowy garmaly, ýygy-ýygydan doňmakdan saklanmaly.
Bölüm kesgitlemesi
Bir bölüm poli (A) • oligo (dT) ulanyp, 37 ° C-de 10 minutda 1 nmol dTTP-ni öz içine alýar25şablon / primer hökmünde.
Hil barlagy
1.SDS-PAGE elektroforetiki arassalygy 98% -den ýokary.
2.Güýçlendirmek duýgurlygy, partiýa-partiýa gözegçilik, durnuklylyk.
3.Hiç hili ekzogen ýadro işjeňligi, ekzogen endonukleýz ýa-da ekzonukleýz hapalanmasy ýok
Ilkinji zynjyrly reaksiýa çözgüdi üçin reaksiýa gurmak
1.Reaksiýa garyndysyny taýýarlamak
| Komponentler | Ses |
| Oligo (dT)12-18 Primer ýa-da tötänleýin başlangyça Gena-da gen aýratyn primerlerb | Agşam 50 |
| Agşam 50 (agşam 20-100) | |
| Agşam 2 | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Şablon RNK | Jemi RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNase mugt dH2O | 10 μL çenli |
Bellikler:a / b: Synag zerurlyklaryňyza görä dürli görnüşli primerleri saýlaň.
2.65 minutda 5 minut gyzdyryň we buzda 2 minut çalt sowadyň.
3.Aboveokardaky sistema jemi 20µL göwrümine aşakdaky bölekleri goşuň we ýuwaşlyk bilen garmaly:
| Komponentler | Ses (μL) |
| 5 × Birinji hatar bufer | 4 |
| Neoscript ters transkriptaz (200 U / μL) | 1 |
| RNase inhibitory (40 U / μL) | 1 |
| RNase mugt dH2O | 20 μL çenli |
4. Reaksiýany aşakdaky şertlere laýyklykda ýerine ýetiriň:
(1) Tötänleýin Primer ulanylsa, reaksiýa 25 min 10 minutda, soňra 50 30 30 ~ 60min üçin amala aşyrylmalydyr;
(2) “Oligo dT” ýa-da ýörite desgalar ulanylsa, reaksiýa 50 at 30 ~ 60min.
5.Neoscript ters transkriptazyny hereketsizleşdirmek we reaksiýany ýatyrmak üçin 5 minut üçin 95 at gyzdyryň.
6.Tersine transkripsiýa önümleri gönüden-göni PCR reaksiýasynda we floresan mukdar PCR reaksiýasynda ulanylyp bilner ýa-da -20 at uzak wagtlap saklanyp bilner.
PCR R.eaksiýa ：
1.Reaksiýa garyndysyny taýýarlamak
| Komponentler | Konsentrasiýa |
| 10 × PCR bufer (dNTP mugt, Mg² + mugt) | 1 × |
| dNTP (her dNTP 10mM) | 200 MM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNK polimeraza (5U / μL) | 2-2.5 U. |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 MM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 MM |
| Şablona | ≤10% Ilkinji zynjyr reaksiýasynyň çözgüdi (2 μL) |
| ddH2O | 50 μL çenli |
Bellikler:J: Eger gaty köp zynjyr reaksiýa çözgüdi goşulsa, PCR reaksiýasy päsgel berip biler.
2.PCR reaksiýa tertibi
| Stepdim | Temperatura | Wagt | Sikller |
| Denaturasiýa | 95 ℃ | 2-5 minut | 1 |
| Denaturasiýa | 95 ℃ | 10-20 sek | 30-40 |
| Annealing | 50-60 ℃ | 10-30 sek | |
| Giňeldiş | 72 ℃ | 10-60 sek |
Bellikler
1.42 ℃ ~ 55 range aralygynda ters transkripsiýa temperaturasyny optimizasiýa üçin amatly.
2.Has oňat durnuklylygy bar, ýokary temperatura ters transkripsiýa güýçlendirmek üçin amatly.Mundan başga-da, RNK-nyň çylşyrymly gurluş sebitlerinden netijeli geçmek üçin amatlydyr.Şeýle hembir basgançakly multiplex floresan mukdar RT-PCR kesgitlemek üçin amatlydyr.
3.Dürli PCR güýçlendiriji fermentleri bilen oňat utgaşyklyk we ýokary duýgurlyk RT-PCR reaksiýalary üçin amatly.
4.Highokary duýgurlyk üçin bir basgançakly floresan mukdar RT-PCR reaksiýasy, şablonlaryň pes konsentrasiýasynyň ýüze çykarylyş tizligini netijeli ýokarlandyrýar.
5.CDNA kitaphanasynyň gurluşygy üçin amatly.
