mRNA Cap2'-O-Metiltransferaza

mRNA Cap 2´ -O-metiltransferaza mRNA Cap 2 ´-O-Metiltransferaza sanjym üçin gen göterýän rekombinant E. coli ştamyndan alyndy.Bu ferment, RNK-nyň 5-nji nokadynda gapagyň gurluşyna ýanaşyk ýerleşýän ilkinji nukleotidiň 2´-O ýagdaýynda metil toparyny goşýar. Ferment S-adenosilmethionini (SAM) metil donor hökmünde ýapylan RNK (gapak) üçin metil donory hökmünde ulanýar. -0) netijede baş harp gurluşy.

Cap1 gurluşy, transfeksiýada we mikroinjeksiýa synaglarynda mRNA-nyň aňlatmasyny gowulandyryp, terjime netijeliligini ýokarlandyryp biler. Bu ferment substrat hökmünde m7GpppN gapagy bolan RNK-ny aýratyn talap edýär.5´ ujunda pN, ppN, pppN ýa-da GpppN bilen RNK ulanyp bilmeýär.Örtülen RNK, vitro transkripsiýasy arkaly gapak analogyny ýa-da Waksiniýa ýapmak fermentini ulanyp ferment taýdan ýapmak arkaly taýýarlanyp bilner.

Komponentler

mRNA Cap 2´-O-Metiltransferaza (50U / μL)

10 aping Tapmak reaksiýasy buferi

Saklamak

Saklamak üçin -25 ～ - 15 repeated Doňdurma aýlawlaryndan gaça duruň）

Saklaýyş buferi

20 mM Tris-HCl （pH 8.0，25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100 ， 50% gliserol.

Bölüm kesgitlemesi

Bir birlik, 37 ° C-den 1 sagadyň dowamynda 80 sany ýapyk RNK transkripsiýasynyň 10 pmolyny metilleşdirmek üçin zerur ferment mukdary hökmünde kesgitlenilýär.

Hil gözegçiligi

Exonuclease: 50U mRNA cap 2 ´ -O-Metiltransferaza, 1μg λ-Hind III siňdiriji DNK 37 at 16 sagatda 16 sagatlap agarose gel elektroforezi bilen kesgitlenişi ýaly hiç hili peselme bermeýär.

Endonukleý: 50 U mRNA cap 2 ´ -O-Metiltransferaza, 1 μg λDNA bilen 37 at 16 sagatda 16 sagatlap agarose gel elektroforezi bilen kesgitlenişi ýaly hiç hili peselme bermeýär.

Nikase: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Metiltransferaza, 1μg pBR322 bilen 37 at 16 sagatda 16 sagatlap agarose gel elektroforezi bilen kesgitlenişi ýaly hiç hili peselme bermeýär.

RNase.

E. coli DNK: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Metiltransferaza barlygy üçin barlanýarE. coli üçin niýetlenen primerler bilen TaqMan qPCR ulanyp genom DNKE. coli 16S rRNA bölümi.TheE. coli genom DNK hapalanmagy = 1E. coli genom.

Bakterial Endotoksin: LAL-test, Hytaýyň Pharmacopoeia IV 2020 neşirine görä, gel çäklendirilen synag usuly, umumy düzgün (1143).Bakterial endotoksin düzümi = 10 EUB / mg bolmaly.

Reaksiýa ulgamy we şertleri

1. 1,5 ml mikrofuge turbasynda degişli mukdarda Capped RNA we RNase-H2O-ny iň soňky göwrümi 16.0 µL birleşdiriň.

2. 65 at-da 5 minut gyzdyryň, soň bolsa 5 minut buzly hammam.

3. Görkezilen tertipde aşakdaky komponentleri goşuň (ýapylan RNK-nyň metilizasiýasy üçin)

10-dan az

* 10 aping Tutuş reaksiýa buferi: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. 37 at-da 1 sagatlap inkubasiýa ediň (200 nt-den pes bolmadyk bölek üçin 2 sagat inkubasiýa maslahat berilýär).

Goýmalar

Mikroinjeksiýa we transfeksiýa synaglary wagtynda mRNA aňlatmasyny gowulandyrmak.

Ulanyş barada bellikler

1. Reaksiýadan öň RNK arassalanmaly we nukleuzsyz suwda eremeli, ähli çözgütlerde hiç hili EDTA we ion bolmaly däldir.

2. Transkripsiýanyň 5´endäki ikinji derejeli gurluşy aýyrmak üçin reaksiýadan öň RNK nusgasyny 65 at 5 minutda gyzdyrmak maslahat berilýär.Çylşyrymly 5 ter terminaly gurluş üçin 10 minuda çenli uzaldylyp bilner.