Waksinýa wirusyny ýapmak fermenti
Waksiniýa wirusyny ýapmak fermenti rekombinant E. coli ştammyndan emele gelýär, Waksiniýa ýapmak fermenti üçin genleri göterýär.Bu ýeke ferment iki kiçi bölümden (D1 we D12) ybarat bolup, üç ferment işjeňligine eýe (D1 subunitiniň RNK trifosfataz we guaniltransferaza we D12 subunitiniň guan metiltransferaza).Waksiniýa wirusy Kapsing fermenti, RNK-nyň 5 ′ ujuna 7-metilguanylat gapagy gurluşyny (m7Gppp, Cap 0) ýörite birikdirip bilýän gapak gurluşynyň emele gelmegini katalizirlemek üçin täsirli.Capapyk gurluşy (Cap 0) mRNA durnuklaşdyrmakda, eukariotlarda daşamakda we terjime etmekde möhüm rol oýnaýar.Enzimatiki reaksiýa bilen RNK-ny ýapmak, vitro transkripsiýasy, transfeksiýasy we mikroinjeksiýa üçin RNK-nyň durnuklylygyny we terjimesini ep-esli gowulandyryp biljek täsirli we ýönekeý usuldyr.
Komponentler
Waksiniýa wirusyny ýapmak fermenti (10 U / μL)
10 aping Bufer
Saklamak şertleri
Saklamak üçin -25 ～ - 15 repeated Gaýtadan doňdurma sikllerinden gaça duruň）
Saklaýyş buferi
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,
1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% gliserol.
Bölüm kesgitlemesi
Waksiniýa wirusynyň gaplaýyş fermentiniň bir birligi, 37 ° C-den 1 sagatda 10pmol GTP-ni 80nt transkripsiýasyna goşmak üçin zerur ferment mukdary hökmünde kesgitlenilýär.
Hil barlagy
Exonuclease:Waksinýa wirusynyň 10U, 1μg λ-Hind III siňdiriji DNK bilen 37 at 16 sagadyň dowamynda 16 sagatlap agarose gel elektroforezi bilen kesgitlenişi ýaly hiç hili peselme bermeýär.
Endonukleý:Waksiniýa wirusynyň 10U, 1μg λDNA bilen 37 at 16 sagatda 16 sagatlap agarose gel elektroforezi bilen kesgitlenişi ýaly hiç hili peselme bermeýär.
Nikase:Waksinýa wirusynyň 10U, 1 μg pBR322 bilen 37 at 16 sagatda 16 sagatlap agarose gel elektroforezi bilen kesgitlenişi ýaly hiç hili peselme bermeýär.
RNase:Waksinýa wirusynyň 10U, 1,6μg MS2 RNA bilen 37 at 4 sagatlap 4 sagatlap agarose gel elektroforezi bilen kesgitlenişi ýaly hiç hili peselme bermeýär.
1.coli DNK:Waksiniýa wirusynyň 10U ýapmak fermenti, E. coli 16S rRNA ýerleşýän ýeri üçin ýörite TaqMan qPCR ulanyp, E. coli genom DNK-nyň barlygy üçin barlanýar.E. coli genom DNK hapalanmagy ≤1 E. coli genomy.
2.Bakterial Endotoksin: LAL-synag, Hytaýyň Pharmacopoeia IV 2020 neşirine görä, gel çäklendiriş synag usuly, umumy düzgün (1143).Bakterial endotoksin düzümi ≤10 EU / mg bolmaly.
Reaksiýa ulgamy we şertleri
1. Kapot protokoly (reaksiýanyň göwrümi: 20 μL)
Bu amal, 10μg RNK (≥100 nt) ýapyş reaksiýasyna degişlidir we eksperimental talaplara görä ulaldylyp bilner.
I) 1,5μ mikrofuge turbasynda 10μg RNK we Nukleýsiz H2O-ny iň soňky göwrüme 15.0 µL birleşdiriň.* 10 aping Bufer buferi: 0,5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8.0)
2) 65 at-da 5 minut gyzdyryň, soň bolsa 5 minut buz wannasy.
3) Görkezilen tertipde aşakdaky bölekleri goşuň
| Ckomponent | Volume |
| Denatirlenen RNK (≤10μg, uzynlygy ≥100 nt) | 15 μL |
| 10 aping Bufer buferi * | 2 μL |
| GTP (10 mM) | 1 μL |
| SAM (2 m) | 1 μL |
| Waksiniýa wirusy Kapsing fermenti (10U / μL) | 1 μL |
* 10 aping Bufer buferi ： 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH8.0)
4) 37 ° C-de 30 minutlap inkubasiýa ediň, RNK indi ýapyk we aşaky programmalar üçin taýýar.
2. 5 ′ terminal bellikleme reaksiýasy (reaksiýanyň göwrümi: 20 μL)
Bu teswirnama 5´ trifosfat bolan RNK bellemek üçin döredildi we talaplara görä ulaldylyp bilner.Etiketkany birleşdirmegiň netijeliligine RNK: GTP, şeýle hem RNK nusgalarynda GTP mazmuny täsir eder.
1) 1,5 ml mikrofuge turbasynda degişli mukdarda RNK we Nukleizsiz H2O-ny iň soňky göwrümi 14.0 µL birleşdiriň.
2) 65 at-da 5 minut gyzdyryň, soň bolsa 5 minut buz wannasy.
3) Görkezilen tertipde aşakdaky bölekleri goşuň.
| Ckomponent | Volume |
| Denatirlenen RNK | 14 μL |
| 10 aping Bufer | 2 μL |
| GTP garyndysy ** | 2 μL |
| SAM (2 m) | 1 μL |
| Waksiniýa wirusy Kapsing fermenti (10U / μL) | 1 μL |
** GTP MIX GTP we az sanly markeri aňladýar.GTP konsentrasiýasy üçin serediň3-nji bellik.
4) 37 ° C-de 30 minut inkubasiýa ediň, RNA 5 ′ ujy indi bellik edildi we aşaky akymlara taýýar
Goýmalar
1. Terjime analizlerinden / in vitro terjimesinden öň mRNA ýapmak
2. mRNA-nyň 5´ ujuny bellemek
Ulanyş barada bellikler
1.Waksiniýa ýapmak fermenti bilen inkubasiýa etmezden ozal RNK erginini gyzdyrmak, transkripsiýanyň 5-nji böleginde ikinji derejeli gurluşy aýyrýar.Belli ýokary gurluşly 5´end ýazgylary üçin 60 minut wagt uzadyň.
2. Reaksiýalary ýapmak üçin ulanylýan RNK, ulanmazdan ozal arassalanmaly we nukleuzsyz suwda saklanmalydyr.EDTA ýok bolmaly we çözgüdi duzsyz bolmaly.
3. 5´ ujuny bellemek üçin, umumy GTP konsentrasiýasy reaksiýada mRNA-nyň mol konsentrasiýasyndan 1-3 esse töweregi bolmaly.
4. Reaksiýa ulgamynyň göwrümi hakykylygyna görä ulaldylyp ýa-da peseldilip bilner.
