DNK çykarmak kiçi toplumy
Bu toplum, optimal bufer ulgamyny we TAE ýa-da TBE agarose jeliniň dürli konsentrasiýalaryndan 70 at güýji - 20 kb DNK böleklerini dikeldip bilýän silisiýa jel sütünini arassalamak tehnologiýasyny kabul edýär.DNK adsorbsion sütüni ýokary duzly ýagdaýda DNK-ny ýörite siňdirip biler.Mundan başga-da, toplum DNK böleklerini PCR önümlerinden, ferment reaksiýa ulgamlaryndan ýa-da beýleki usullar bilen alnan çig DNK önümlerinden arassalap biler we beloklar, beýleki organiki birleşmeler, organiki däl duz ionlary we oligonukleotid primerleri ýaly hapalary aýryp biler.Arassalamagyň 10-15 minutyň içinde tamamlanmagyny üpjün edip biler.Arassalanan DNK gönüden-göni baglamak, üýtgetmek, ferment siňdiriş, in vitro transkripsiýa, PCR, yzygiderlilik, mikroinjeksiýa we ş.m. ulanylyp bilner.
Saklamak şertleri
-15 ~ -25 at derejesinde saklaň we otag temperaturasynda daşaň.
Komponentler
| Komponentler | (100 rxns) |
| Bufer jemi içerki önüm | 80 ml |
| Bufer GW | 2 × 20 ml |
| Elution Bufer | 20 ml |
| “FastPure DNA” kiçi sütünleri-G | 100 |
Bufer jemi içerki önüm:DNK baglaýjy bufer.
Bufer GW:Kir ýuwmak buferi;ulanmazdan ozal çüýşäniň görkezilen göwrümi boýunça mutlak etanol goşuň.
Elution Buffer:Elution.
“FastPure DNA” kiçi sütünleri-G:DNK adsorbsion sütünleri.
Kolleksiýa turbalary 2 ml:Süzgüç üçin ýygnamak turbalary.
Taýýarlanan materiallar
1,5 ml sterilizasiýa turbalary, mutlak etanol we izopropanol (DNK bölegi ≤100 bp bolanda, 1 göwrüm goşuň
izopropanol 1 göwrümli jel), suw wannasy.
Synag prosesi
Bufer GW-ni ulanmazdan ozal bellikde görkezilişi ýaly 80 ml etanol goşuň, otag temperaturasynda saklaň.
Mehanizm
1. PCR reaksiýa çözgüdi
Gel çykarmak shemasy: Deň göwrümli bufer goşuň PCR reaksiýa çözgüdi dikeldiş shemasy:Buferiň göwrüminden 5 esse goşuň
2. JIÖ Geliň mukdaryny hasaplaň (100) μl 100 mg deňdir)
Gelini eritiň
3. 50 ~ 55-de gyzdyryň℃
4. Bashuwuň
Bufer jemi içerki önüminiň 300 μL goşuň *
700 μL Buffer GW goşuň
700 μL Buffer GW goşuň
5. Elute
20 - 30μL Elution Bufer ýa-da deionizirlenen suw goşuň
Bellikler * Bu ädim bolmasa PCR reaksiýa suwuklygynyň dikeldilmegi
Gel çykarmak programmasy
1. DNK böleklerini bölmek üçin DNK elektroforezinden soň, UV çyrasynyň aşagyndaky agarose jelinden DNK bölekleriniň bir zolagyny çykaryň.Geliň görünýän çyglylygyny siňdirmek we mümkin boldugyça goşmaça agarozany aýyrmak bilen jel diliminiň ululygyny azaltmak üçin sorujy kagyzy ulanmak maslahat berilýär.Sesini hasaplamak üçin jel dilimini (mikrosentrifuge turbasyz) ölçäň: Dykyzlygy 1g / ml diýip göz öňünde tutup, 100 mg jellisiň göwrümi takmynan 100 μL.
2. Deň göwrümli bufer jemi içerki önümi goşuň, 7-10 minut üçin 50 ~ 55 at inkubasiýa ediň (jeliň ululygyna görä, jel doly erýänçä inkubasiýa wagtyny sazlaň).Inkubasiýa wagtynda turbany 2 gezek öwüriň.
Buff Bufer jemi içerki önüminiň 1-3 jiltiniň goşulmagy DNK-nyň dikeldiş netijeliligine täsir etmez.DNK bölegi dikeldilmeli bolsa <100 bp, bufer jemi içerki önümiň 3 tomy goşulmaly;jel dilim doly eränsoň, 1 göwrümli izopropanol goşuň we gowy garmaly, soňra indiki ädimiňize dowam ediň.
3. Nusgany turbanyň düýbüne getirmek üçin “Centrifuge” gysgaça, “FastPure DNA Mini Sütünleri-G” kolleksiýa turbalaryna 2 ml salyň, ergini iň ýokary 700 μL bir gezek üns bilen geçiriň.
süzgüç sütünlerine wagt, sentrifuga 12,000 aýlawda (13,800 X g) 30-60 sek.
4. Süzgüdi taşlaň we sütüne 300 μL Bufer jemi içerki önüm goşuň, otag temperaturasynda 1 minut inkubasiýa ediň, sentrifuga 12,000 aýlawda (13,800 X g) 30-60 sek.
5. Süzgüdi taşlaň we sütüne 700 μL Buffer GW goşuň (mutlak etanolyň öňünden goşulandygyny ýa-da ýokdugyny barlaň!), 30-60 sekuntda 12,000 aýlawda (13,800 X g) sentrifuga.
Ad adsorbsion sütün diwaryna Buffer GW goşuň, ýa-da Buffer GW arka gapagyny goşuň we turba diwaryna ýapyşýan duzy doly ýuwmaga kömek etmek üçin 2 - 3 gezek garyşdyryň.
6. 5-nji ädimi gaýtalaň.
Buff Buffer GW bilen iki gezek ýuwulmak, duzuň doly aýrylmagyny we indiki synaglara täsirini ýok edip biler.
7. Filtri taşlaň we boş sütüni 12,000 aýlawda (13,800 X g) 2 minutda merkezden gaçyryň.
8. Sütüni arassa 1,5 ml mikrosentrifuge turbasyna salyň, sütün membranasynyň merkezine 20-30 μL Elution Bufer goşuň, 2 minut inkubasiýa ediň, soňra bolsa 12,000 aýlawda (13,800 X g) 1 minut üçin sentrifuga.Sütüni taşlaň, alnan DNK -20-de saklaň.
8 8-nji ädimiň adatdan daşary tebigatyny gaýtadan sütüne geçirmek we Elution Buferini 55-e çenli gyzdyrmak (DNK bölegi> 3 kb bolanda) dikeldiş netijeliligini ýokarlandyrmak üçin peýdalydyr.
PCR önümlerini dikeltmek programmasy
Bu teswirnama PCR önümlerinden, ferment reaksiýa ulgamyndan we beýleki DNK çig önümlerinden (genetiki DNK-ny goşmak bilen) DNK böleklerini arassalamak üçin ulanylýar.Bu çözgüt dürli nukleotidleri, primerleri, başlangyç ölçegleri, duz molekulalaryny, fermentleri we beýleki hapalary netijeli aýyryp biler.
1. Gysgaça sentrifuga PCR önümleri, ferment reaksiýa çözgüdi we beýleki DNK çig önümleri.Olaryň göwrümini turba bilen bahalandyryň we sterilizasiýa edilen 1,5 ml ýa-da 2 ml turba geçiriň.Sesi 100 μL çenli ddH2O goşuň;ýokary konsentrasiýaly genom DNK üçin 300 μL ddH2O bilen eritmek dikeldiş netijeliligini ýokarlandyrmaga kömek eder.
2. Bufer jemi içerki önümiň 5 tomuny goşuň, tersine ýa-da worteksing bilen gowy garmaly.Eger DNK göterim bölegi> 100 bp bolsa, etanolyň goşmaça 1,5 tomy (nusgalar + Bufer jemi içerki önümi) goşulmaly.
3. Sütüni ýygnamak turbasyna salyň, mikstruny sütüne geçiriň, 12,000 aýlawda (13,800 × g) 30 - 60 sek.Garyşyk erginiň göwrümi> 700 µL bolsa, adsorbsion sütünini ýygnamak turbasyna goýuň, galan çözgüdi adsorbsion sütünine we sentrifuga 12,000 aýlawda (13,800 × g) 30 - 60 sek.
4. Indiki çykyş, 08- 1 / Gel çykarmak programmasynyň 5 - 8 ädimine degişlidir.
Goýmalar
TAE ýa-da TBE agarose jeliniň dürli konsentrasiýalary;PCR önümleri, ferment reaksiýa ulgamlary ýa-da dürli usullar bilen alnan beýleki çig DNK önümleri.Dikeldilen bölekler70 bp -20 kb.
Bellikler
Gözleg üçin diňe ulanyň.Kesel anyklaýyş amallarynda ulanmak üçin däl.
1. Bufer GW-ni ulanmazdan ozal bellikde görkezilişi ýaly 80 ml etanol goşuň, otag temperaturasynda saklaň.
2. Buferiň jemi içerki önümi pes temperatura saklanylanda çökdürmek aňsat bolsa, ulanmazdan ozal belli bir wagtlap otag temperaturasynda ýerleşdirilip bilner.Zerur bolsa, çökündiler doly erýänçä 37 ℃ suw wannasynda gyzdyrylyp bilner, soň bolsa garylandan soň ulanylyp bilner.
3. Suw wannasynyň temperaturasyny 50 ~ 55 to öňünden düzüň.
4. 08-1 / Gel çykarmak programmasynyň 1-nji ädiminde jel diliminiň ululygyny kiçeltmek, ereýän wagty ep-esli azaldar we dikeldiş netijeliligini ýokarlandyrar (Lineokary temperaturada yzygiderli täsir edilende çyzykly DNK gidrolizlemek aňsat).DNK jelini UV-e uzak wagtlap goýmaň, sebäbi ultramelewşe ýagtylyk DNK-nyň zaýalanmagyna sebäp bolup biler.
5. Jeli 08- 1 / Gel çykarmak programmasynyň 2-nji ädiminde doly eritiň, ýogsam DNK-nyň dikeldiş netijeliligine çynlakaý täsir eder.
6. DNK-nyň elitasiýa netijeliligini ýokarlandyrmak üçin peýdaly Elution Buferini ýa-da ddH2O-dan 55 to çenli gyzdyryň.DNK-ny 2,5 mM Tris-HCl, pH 7.0 - 8.5 derejesinde saklamak maslahat berilýär.
