Göni PCR toplumyny oturdyň
Pişik belgisi: HCR2020A
Ösümlik göni PCR toplumy ösümlik ýapraklaryny, tohumlaryny we ş.m. gönüden-göni güýçlendirmek üçin amatlydyr we polisakaridleri we polifenollary öz içine almaýan ösümlik nusgalaryny ýokary hilli barlamak üçin ulanylyp bilner.Göni güýçlendirme DNK polimeraza gönükdirilen ewolýusiýa esasynda ösümliklerdäki PCR ingibitorlaryna has ýokary çydamlylygy bar.Şol bir wagtyň özünde, 5 kb içinde DNK böleklerini güýçlendirmek üçin amatly ýokary güýçlendiriji öndürijiligini saklaýar.Toplumdaky täsin Lizis buferi A täze ýa-da doňan ösümlik dokumalaryny lizlemek üçin ulanylyp bilner.Işlemek aňsat we lizat arassalanmazdan güýçlendirmek üçin şablon hökmünde ulanylyp bilner.Ulgamda yzygiderli doňdurylandan we eremeden soň çig nusgalary netijeli güýçlendirmäge mümkinçilik berýän gorag serişdeleri bar.2 × Ösümlik Direct Master Mix diňe güýçlendirme reaksiýasyny ýerine ýetirmek üçin primerleri we şablonlary goşmaly, şeýlelik bilen turba geçiriji amallary azaldýar we netijeleriň ýüze çykarylyşyny we köpelişini gowulandyrýar.
Komponentler
| Komponentler | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 Direct Ösümlikleriň göni garyndysy | 1,25 ml | 4 × 1,25 ml |
| Ösümlik göni lizis buferi A. | 5 ml | 20 ml |
| Ösümlik göni lizis buferi B * | 5 ml | 20 ml |
* Ösümlik göni lizis buferi B goşmaça reagent bolup, nusgalaryň saklanyş möhletini uzaltmak üçin ösümlik göni lizis buferini zyýansyzlandyrmak üçin ulanylýar.Hakyky ýagdaýa görä ulanylyp bilner.
Saklamak şertleri
2 Direct Ösümlik göni ussasy garyndysyny, -30 ~ -15 at saklaň we gaýta doňmakdan we eremekden saklaň;Ösümlik göni lizis buferi, -30 ~ -15 ℃ ýa-da 2 ~ 8 at saklaň.
Synag prosesi
Nusga gaýtadan işlemek-Ösümlik ýapragy
Göni usul:Youngaş ýapraklary ulanmak maslahat berilýär.Kiçijik we birmeňzeş nusga almak üçin kesgitlenen diametri 0,5 - 3 mm bolan deşik zarbasyny ulanyň we nusgany göni PCR ulgamyna goşuň (50 systeml ulgamy maslahat berilýär).Üns beriň, nusganyň turba diwaryna däl-de, PCR erginine degişlidigine göz ýetiriň.Uzyn bölekleri we çylşyrymly nusgalary güýçlendirmek üçin gönüden-göni PCR ulanylsa, has kiçi diametri (0,5 - 1 mm) şablon hökmünde ulanmak has gowy netijeleri gazanmaga kömek edip biler.
Griz liziz usuly:Youngaş ýapraklary ulanmak maslahat berilýär.Kiçijik ýaprak bölejigini alyň (diametri takmynan 1 - 3 mm), 20 μl ösümlik göni lizis bufer ab-a ýerleşdiriň we mümkin boldugyça üwüriň (bu ädim ýapragy 100 μl turbanyň ujy bilen gysyp amala aşyrylyp bilner. nusgasyny ýuwmak).Leafaprak dokumalarynyň has uly mukdary ulanylsa (7 mm-den geçmeli däl), eritme buferiniň göwrümini 50 μl çenli ýokarlandyryň.Leavesapraklary ýere düşensoň, ergin ýaşyl görünmeli.Gysga merkezden gaçyryşdan soň, reaksiýa şablony hökmünde PCR ulgamyna 1 μl adatdan daşary tebigaty goşuň.
Malylylyk liz usuly:Youngaş ýapraklary ulanmak maslahat berilýär.Kiçijik ýaprak bölejigini alyň (diametri takmynan 1 - 3 mm), 20 μl ösümlik göni lizis bufer A-da goýuň we 95 ° C-de 5-10 minut gyzdyryň.Lizlemek wagty ýapmak kyn bolan ýapraklar üçin (20 minutdan köp bolmaly däl) uzaldylyp bilner.Leafaprak dokumalarynyň has uly mukdary ulanylsa (7 mm-den geçmeli däl), eritme buferiniň göwrümini 50 μl çenli ýokarlandyryň.Heatingyladylandan soň, sentrifugany gysga wagtda we reaksiýa şablony hökmünde PCR ulgamyna 1 μl adatdan daşary tebigat goşuň.
Nusga gaýtadan işlemekAnt Ösümlik tohumy
Griz liziz usuly:Diametri 5 mm bolan tohumlary kesmek üçin, skalpel ulanyň, 100 μl ösümlik göni lizis bufer A-a goşuň we nusgany turba ujy ýa-da beýleki gurallar bilen üwäň.Worteks gysgaça we otag temperaturasynda 3-5 minut durmaly.Tohum nusgasynyň eritme buferinde gark bolandygyna göz ýetiriň.Gysga merkezden gaçyryşdan soň, reaksiýa şablony hökmünde PCR ulgamyna 1 μl adatdan daşary tebigaty goşuň.
Malylylyk liz usuly:Diametri 5 mm bolan tohumlary kesmek üçin, skalpel ulanyň, 100 μl ösümlik göni lizis bufer A-a goşuň we 95 ° C-den 5-10 minut gyzdyryň.Lizlemek wagty ýapmak kyn bolan ýapraklar üçin (30 minutdan köp bolmaly däl) uzaldylyp bilner.Heatingyladylandan soň, gysga wagtda sentrifugany we reaksiýa şablony hökmünde PCR ulgamyna 1 sup supernatant goşuň.
a.Gaýçy ýa-da beýleki gurallar hem laýyk ölçegdäki nusgalary kesmek üçin ulanylyp bilner;pyçak ýa-da gaýçy gaýtadan ulanylsa, nusgalaryň arasynda hapalanmazlyk üçin her gezek ulanmazdan ozal 2% natriý gipohlorit ergini bilen arassalanmalydyr.
b.Ösümlik göni lizis buferiniň ulanylmazdan ozal doly eremegine göz ýetiriň.Bufer ýapyşykly ýa-da çökündileri bar bolsa, ulanmazdan ozal doly eritmek üçin 37 at-da gyzdyryp bolýar.
c.Reaksiýa ulgamyndaky şablonyň göwrümi ösümlik materialynyň we goşulan suwuklygyň tapawudyna görä laýyk düzedilip bilner.
Göni göni lizis buferi
Ösümlik göni lizis buferi Bu önümdäki ösümlik dokumalarynyň köpüsiniň genomyny çykarmak üçin berk optimallaşdyryldy we çig ösümlikleri gysga wagtda 4 at saklamak üçin amatly.Nusgany has uzak wagtlap saklamaly bolsa (meselem, 1 - 2 aý), adatdan daşary tebigaty täze EP turbasyna geçirmek we -20 at saklamak maslahat berilýär.Nusgalary has durnukly saklamak üçin, göçürilen adatdan daşary tebigata deň mukdarda ösümlik göni lizis bufer B goşuň, gowy garmaly we -20 at derejesinde saklaň.Durnukly saklanyş wagty ösümlik nusgalaryna we ýagdaýlaryna görä üýtgeýär.
Reaksiýa ulgamy
| ddH2O | 20.0 µl | 50.0 µl |
| 2 Direct Ösümlikleriň göni garyndysya | 10.0 µl | 25.0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Ösümlik ýapragy / çig ekstrakt nusgasy(Nusga gaýtadan işlemäge serediň) | 0,5 - 3 mm ýaprakly disk / x µl | 0,5 - 3 mm ýaprakly disk / x µl |
a.Onda Mg bar2+iň soňky konsentrasiýasynda 2 m.
b.Her primer üçin iň soňky 0,4μM konsentrasiýasyny ulanmak maslahat berilýär.Astarlary aşa köp ulanmak, belli bolmadyk güýçlendirilmegine getirer.
c.Ulanylan nusganyň mukdary hakyky ýagdaýa görä düzedilip bilner.Çig lizirlenen nusganyň ýekeje reaksiýasynda ulanylýan mukdar, reaksiýanyň umumy göwrüminiň 2% - 20% arasynda sazlanyp bilner.Artykmaç nusgalary ulanmak güýçlendirme şowsuzlygyna sebäp bolup biler.
Reaksiýa maksatnamasy
| Dimler | Temperatura | Wagt |
| Başlangyç denatasiýa | 98 ℃ | 5 min |
| Denaturasiýa | 95 ℃ | 10 sek |
| Annealing | 58 ~ 72 ℃ | 15 sek |
| Giňeldiş | 72 ℃ | 30 sek |
| Jemleýji giňeltme | 72 ℃ | 5 min |
a.Başlangyç denaturasiýa (98 ℃, 5 min) ösümlik dokumalarynyň lizisini ýokarlandyrýar, PCR güýçlendirmek üçin ulanyp boljak genom DNK-ny çykarýar.Wagty gysgaltmaň ýa-da temperaturany peseltmäň.
b.Ony başlangyç Tm bahasyna ýa-da Tm bahasyndan 2 ~ 4 ℃ ýokary goýmak maslahat berilýär.Bu önümde ulanylýan gönüden-göni güýçlendirme DNK polimeraza adaty Taq DNK polimerazasyndan tapawutlanýar we reaksiýanyň anneal temperaturasyna aýratyn talaplary bar high ýokary anneal temperaturanyň ulanylmagy belli bolmadyk güýçlendirmäni peseldip we güýçlendirmek netijeliligini ýokarlandyryp biler.Çylşyrymly galyplar üçin täsirli güýçlendirme, gyzdyryjy temperaturany sazlamak we uzaldyş wagtyny uzaltmak arkaly gazanylyp bilner.
c.Güýçlendiriji önümiň uzynlygy ≤1 kb bolsa, uzaldyş wagty 30 sek / kb-da kesgitlenýär;güýçlendiriji önümiň uzynlygy> 1 kb bolsa, uzaldyş wagty 60 sek / kb-da kesgitlenýär.
d.Güýçlendirme pes hasylly çylşyrymly nusgalar ýa-da nusgalar üçin siklleriň sanyny degişli derejede 40 -50 sikle çenli köpeldip bolar.
Goýmalar
Ösümlik dokumalaryny gönüden-göni güýçlendirmek we polisakaridleri we polifenollary öz içine almaýan ösümlik nusgalaryny ýokary derejeli barlamak üçin ulanylýar.
Bellikler
Gözleg üçin diňe ulanyň.Kesel anyklaýyş amallarynda ulanmak üçin däl.
1. Çig ösümlikleri güýçlendirmek ýa-da gönüden-göni güýçlendirmek üçin, ulgamyň, desgalaryň we amallaryň dogrudygyny anyklamak üçin synag başlamazdan ozal arassa genom DNK-ny oňyn gözegçilik hökmünde ulanmak maslahat berilýär.
2. Bu toplumda ulanylýan gönüden-göni güýçlendiriji DNK polimeraza güýçli barlag işjeňligi bar.TA klonirlemeli bolsa, adenini goşmazdan ozal DNK-ny arassalamak maslahat berilýär.
3. Esasy dizaýn gollanmasy ：
a.Astaryň 3 ′ ujundaky iň soňky bazanyň G ýa-da C bolmalydygy maslahat berilýär.
b.Astaryň 3 ′ ujundaky soňky 8 bazada yzygiderli gabat gelmezliklerden gaça durmaly.c.Astaryň 3 ′ ujundaky saç düzümlerinden gaça duruň.
d.Öňe sürülýän desganyň we ters primeriň Tm bahasyndaky tapawutlar 1 than-dan köp bolmaly däldir we Tm bahasy 60 ~ 72 to düzedilmelidir (Primer Premier 5 Tm bahasyny hasaplamak maslahat berilýär).
e.Şablon bilen gabat gelmeýän goşmaça goşmaça primer yzygiderliligi, başlangyç Tm bahasy hasaplananda goşulmaly däldir.
f.Astaryň GC mazmunynyň 40% -60% bolmagy maslahat berilýär.
g.Astarda A, G, C we T-iň umumy paýlanyşy mümkin boldugyça bolmaly.Gokary GC ýa-da AT mazmuny bolan sebitleri ulanmakdan gaça duruň.
sag.Astaryň içinde ýa-da iki primeriň arasynda 5 ýa-da has köp bazanyň goşmaça yzygiderliliginden gaça duruň we iki primeriň 3 ′ ujunda 3 ýa-da has köp bazanyň goşmaça yzygiderliliginiň öňüni alyň.
i.Kesgitli güýçlendirilmeginiň öňüni almak üçin primeriň aýratynlygyny barlamak üçin NCBI BLAST funksiýasyny ulanyň.
